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糖尿病の歴史36 インスリン発見前夜 ~血糖測定法の進歩 (3)

血糖測定法の続きです。

1915年にルイスとベネディクトが画期的な血糖測定法を発表します。必要血液量は2mlです。彼らはピクリン酸を用いて手順を単純化しました。ピクリン酸は蛋白を除く作用があり、同時に糖と反応して赤く発色する性質があります(この発色で糖を測定します)。このため蛋白を完全に除去する必要がなくなりました。

改良はさらに続きます。ルイス・ベネディクト原法ではフラスコ内容物を直火で蒸発させる手順があります。マイヤーズとベイリーは最初の血液希釈度を下げることによりこの手順を省略し、100Cのビーカー内で温浴させることで発色を強め、手順をさらに単純化させました(1916年)。ついに洗練された血糖測定法ができたのです。

硝子製の注射器で約2.5mlの血液を採取する。注射器は血液凝固を防ぐため、あらかじめ蓚酸カリウムで濡らしておく。採取した血液は少量の蓚酸カリウムを含む試験管に移す。ピペットで2mlの血液を15-20ml容量の遠心管に移す。ピペットは8mlの水で洗い、その水も遠心管に入れる。この操作で血液を5倍に希釈し、完全に溶血させる。0.2mgの乾燥ピクリン酸を添加し、撹拌棒でよく混和する。蛋白を完全に沈殿させ、溶液をピクリン酸で飽和させ、時々混和しながら数分置く。次に遠心機にかけ、4cm径の濾紙で溶液を濾過し、上清を乾燥した試験管に移す。3mlを背の高い試験管に移し、1mlの20%炭酸ナトリウム溶液を加え、15分間ビーカー内で100Cで温浴させる。この温浴で溶液は完全に発色する(これ以上温浴しても色は変わらない)。室温まで冷却し、発色度合に合わせて水で薄め、比色計で測定する。


バンティングとベスト(1921年インスリン発見)が採用したのは、マイヤーズとベイリーの変法です。


平成28年3月24日

糖尿病の歴史35 インスリン発見前夜 ~血糖測定法の進歩 (2)

今回は1910年前後の血糖測定法の進歩を紹介します。多くの成果があいついで発表され、研究競争も激しかったようです。少し煩雑ですが、当時の雰囲気が伝わってきますので、端折りながら紹介します。

最初にバングの微量化学分析を紹介します(1907年発表、1913に論文)。


100mgの血液を濾紙にしみこませ、重量を特殊なねじり秤で測定し、蛋白を塩化カリウム、酢酸ウラニウム、塩酸溶液で蛋白を「固定」。濾過液を硫酸銅と塩化カリウムを含む溶液内で90秒ほど沸騰させ、その後急速に冷却。酸化を防ぐために二酸化炭素をかぶせる。糖濃度は還元銅をヨード液で滴定(バング考案の精密な目盛り付きの分析用ガラス管使用)、指示薬は澱粉。

バング法では正常人血糖は100-110mg/dl、糖尿病で200mg/dl以上と測定され、妥当な値です。バング法は大変な手間がかかり、繰り返して測定するには難があります。蛋白を「固定」する方法にも少し無理があり、ガードナーは抽出前の濾紙を90-100Cで3-5分熱することで蛋白を凝固させ、蛋白が濾紙から溶出しないよう工夫しました(この工夫で抽出時間を十分にとることができ、精度が上がるそうです)。バング法では濾紙の品質も重要です(当時還元物質を含まない濾紙はあまりなかった)。



1908年にミカエリスが蛋白を除く方法に「沈殿法」を導入しました。ミカエリス-メンテン定数(酵素反応定数)で有名なミカエリスです。ミカエリスは我が国とも関わり合いがあり、1922年に愛知医科大学(現在の名古屋大学)の教授に就任しています。彼はバートランドの測定法を改良し、1mlの血液で可能な血糖測定法を開発しました(1914年)。

ミカエリスは「血糖は蛋白質に結合しておらず、自由な状態で存在する」ことを見つけました。とても大切な発見です。古い方法の多くは「沈殿した蛋白の洗浄作業」(ここで糖を喪失する可能性)があり、新しい濾過液を用いる方法は「蛋白の塊に糖が吸着していない」ことを証明する必要があったからです。

ミカエリス法では糖が酸化第二銅を酸化第一銅に還元する性質を利用し、「沈殿した酸化第一銅を分離」して糖を測定します。しかし糖が少ない時は酸化第一銅の沈殿量が少なく、うまく測定できません。ガードナーは蛋白分離と沈殿物分離のそれぞれに工夫をこらし、蛋白分離には濾紙とリネン綿、沈殿物分離には特別に調整されたアスベストウールを用いることでうまくいくと発表しました(1914)。


平成28年3月3日

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